技术应用
技术与应用问题

1. 什么是色谱法?
答:色谱或是色谱法也称之为色层法或层析法,是一种物理化学分析方法,它利用混合物中各物质在两相间分配系数的差别,当溶质在两相间做相对移动时,各物质在两相之间进行多次分配,从而使各组分得到分离。
 
2. 色谱法的分类?
答:色谱的分类可按两相的状态及应用领域的不同分为两大类。
按流动相和固定相的状态可分为气相色谱和液相色谱。气相色谱分为气固色谱法和气液色谱法。液相色谱又可分为液液色谱法和液固色谱法。
按使用领域不同对色谱仪可分为分析用色谱仪、制备用色谱仪和流程色谱仪。
 
3. 色谱分析的基本原理?
答:混合物中各物质在两相间分配系数的差别,当溶质在两相间做相对移动时,各物质在两相之间进行多次分配,从而使各组分得到分离。
 
4. 什么是高效液相色谱?
答:高效液相色谱法又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支,以液体为流动相,采用高压输液系统。
高效液相色谱用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,经进样阀注入待测样品,由流动相带入柱内,在柱内各成分被分离后,依次进入检测器进行检测,从而实现对试样的分析。
 
5. 高效液相色谱与气相色谱的区别?
答:高效液相色谱与气相色谱的主要区别可归结于以下几点:
(1)进样方式的不同,高效液相色谱只要将样品制成溶液,而气相色谱需加热气化或裂解;
(2)流动相的不同,在被测组分与流动相之间、流动相与固定相之间都存在着一定的相互作用力;
(3)由于液体的粘度较气体大两个数量级,使被测组分在液体流动相中的扩散系数比在气体流动相中约小4~5个数量级;
(4)由于流动相的化学成分可进行广泛选择,并可配置成二元或多元体系,满足梯度洗脱的需要,因而提高了高效液相色谱的分辨率(柱效能);
(5)高效液相色谱采用5~10µm细颗粒固定相,使流动相在色谱柱上渗透性大大缩小,流动阻力增大,必须借助高压泵输送流动相;
(6)高效液相色谱是在液相中进行,对被测组分的检测,通常采用灵敏的湿法光度检测器,例如,紫外光度检测器、示差折光检测器、荧光光度检测器等;
(7)液相色谱与气相色谱相比较,高效液相色谱同样具有高灵敏度、高效能和高速度的特点。
高效液相色谱的定性和定量分析,与气相色谱分析相似,在定性分析中,采用保留值定性,或与其他定性能力强的仪器分析法连用;在定量分析中,采用测量峰面积的归一化法、内标法或外标法等,但高效液相色谱在分离复杂组分式样时,有些组分常不能出峰,因此归一化法定量受到限制,而内标法定量则被广泛使用。
 
6. 高效液相色谱的分类?
答:根据分离机制不同,液相色谱可分为:液固吸附色谱、液液分配色谱、化学键合色谱、离子交换色谱以及分子体积排阻色谱等类型。
 
7. 高效液相色谱仪的主要部件?
答:高效液相色谱的主要部件有:流动相储罐、泵、梯度洗脱装置、检测器。
分析用高效液相色谱仪的流动相储罐常使用1L的锥形瓶加一个电磁搅拌器,在连接到泵入口处的管线上时要加上一个过滤器,以防止溶剂中的固体颗粒进入泵内。为了便于脱气,常需要配备加热器、搅拌器和抽真空及出入惰性气体的装置。
由于现代高效液相色谱都使用小颗粒的填料,有很大的阻力,因此需要高压泵。
进行梯度洗脱的装置可分为两类,高压梯度形成器和低压梯度形成器。
高效液相色谱仪的检测器最常用的有紫外可见分光光度检测器、荧光检测器、二极管阵列检测器、示差折光率检测器、蒸发激光散射检测器和电化学检测器。
 
8. 什么是反相高效液相色谱?
答:所谓反相高效液相色潽法是指以强疏水性的填料作固定相、以能和水混溶的有机溶剂做流动相的液相色谱。这一色谱模式在高效液相色谱中应用极广,是一种通用性的液相色谱方法,可以分离多种混合物。
 
9. 反相高效液相色谱的原理是什么?
答:溶质在填料表面的烃类和流动相之间进行分配。
溶质在吸附于表面烃类上的“改性固定相”和流动相之间进行分配。
溶质吸附于表面烃类分子上,类似于吸附色谱。
 
10. 常用的反相高效液相色谱柱有哪些?
答:
1.常规硅胶键合C18、C8等的填料柱;
2.对硅胶做碱性脱活反相柱;
3.高覆盖量的柱;
4.高稳定性反相柱。
以下是液相色谱填料及色谱柱的主要生产厂家及供应商
 

供应商

商品名

粒径/μm

孔径/nm

Agilent

Zorbax C18

5,7

7

Zorbax C8

3,5,7

7

Zorbax Phenyl

3,5,7

7

Zorbax TMS

3,5,7

7

Zorbax SB-C18

3,5,5,7

8

Zorbax SB-C8

3,5,5,7

8

Zorbax SB-Phe

3,5,5,7

8

Zorbax Rx-C18

5,7

8

Zorbax Rx-C8

5,7

8

Alltech

Adsorbosphere C8

3510

8

Adsorbosphere C18

3510

8

Adsorbosphere Pheyl

3510

8

Adsorbosphere

3510

8

Adsorbosphere TMS

3510

8

Econoxphere C8

5

10

Econoxphere C18

5

10

Ro Sil C3

3,5,8

8

Ro Sil C8

3,5,8

8

Ro Sil C18

3,5,8

8

R Sil C18HL

5,10

6

R Sil C18LL

5,10

6

R Sil Phenyl

5,10

6

Verspack C18

5,10

6

 
11. 反相高效液相色谱流动相中pH缓冲液应如何选择?
答:
1、在pH=2~8之间要有大的缓冲容量;
2、能透过检测器使用的光波;
3、能和有机溶剂相容;
4、能促进平衡速度的提高;
5、可以掩蔽吸附剂表面上的硅醇基。
 
12. 什么是正相高效液相色谱?
答:所谓正相高效色谱是指以亲水基的填料作为固定相,以疏水性溶剂或混合物作流动相的液相色谱。
 
13. 正相高效液相色谱的分离原理?
答:一般来说正相高效液相色谱的分离决定于溶质和固定相及流动相之间的分子间作用力,其中氢键力和静电力起着重要的作用。
 
14. 正相高效液相色谱的应用领域?
答:正相高效色谱主要应用甾醇类、类脂化合物、磷脂类化合物、脂肪酸以及其他化合物。
 
15. 什么是离子交换色谱?
答:离子交换色谱法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。
 
16. 离子交换色谱的分离机理?
答:离子交换色谱(ion exchange chromatography,IEC)以离子交换树脂作为固定相,树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时,组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。
 
17. 常用的离子交换色谱柱?
答:离子交换色谱常用的固定相为离子交换树脂。目前常用的离子交换树脂分为三种形式,一是常见的纯离子交换树脂。第二种是玻璃珠等硬芯子表面涂一层树脂薄层构成的表面层离子交换树脂,第三种为大孔径网络型树脂。它们各有特点,例如第二种树脂有很高的柱效,但它的柱容量不大;第三种树脂适用于非水溶液中物质的分离,因为它们的孔径和内表面积大,不需要用水溶胀,便可满意地使用。
 
 
18. 如何选择离子交换色谱流动相?
答:选择离子交换色谱流动相应满足以下几个条件:
1、应能够充分溶解各种盐并提供离子交换必需的缓冲液;
2、具有合适的离子强度以便控制样品的控制值;
3、对被分离的对象有选择性。
 
19. 什么是离子对色谱?
答:无机离子以及离解很强的有机离子通常可以采用离子交换色谱或离子排斥色谱进行分离。有很多大分子或离解较弱的有机离子需要采用通常用于中性有机化合物分离的反相(或正相)色谱。
 
 
20. 离子对色谱的分类?
答:离子对色谱主要分为两类:正相离子对色谱和反相离子对色谱。
 
21. 反相离子对色谱流动相pH的范围?
答:一般pH=2~7.4比较合适
 
22. 离子对色谱的应用领域?
答:反相离子对色谱在许多领域都得到应用,如无机阴离子、阳离子、生物碱、维生素、抗菌素以及其他药物分析,在生物化学、石油、石油化工等方面也有很多应用。
 
23. 什么是体积排阻色谱?
答:体积排阻色谱是快速分离不同分子量混合物的方法。
 
24. 体积排阻色谱的分离机理?
答:体积排阻色谱的固定相为化学惰性多孔物质——凝胶,凝胶具有一定大小的孔穴,体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻,较早的淋洗出来;中等体积的分子部分渗透;小分子可完全渗透入内,最后洗出色谱柱。这样,样品分子基本按其分子大小先后排阻,从柱中流出。
 
25. 什么是疏水作用色谱?
答:疏水作用色谱是利用样品各组分具有不同的疏水作用的性质进行分离的方法,主要分离对象是蛋白质。
 
26. 疏水作用色谱的分离机理?
答:疏水作用的固定相表面为弱疏水性基团,它的疏水性要比反相色谱用的固定相低几十到几百倍,而流动相为高离子强度的盐溶液。蛋白质在这样的固定相和流动相中进行分配,蛋白质分子上的疏水性基团和固定相的疏水性基团作用而被保留。当用流动相洗脱时逐渐降低流动相的离子强度,蛋白质分子按其疏水性的大小被依次洗脱出来,疏水性小的先流出,疏水性大的后流出。这样的高盐水溶液中,蛋白质不会失活。
 
27. 影响疏水作用色谱的色谱条件?
答:影响疏水作用色谱保留的条件有:
1、固定相的疏水性;
2、流动相的离子强度;
3、酸度;
4、温度。
 
28. 什么是胶束液相色谱?
答:胶束液相色谱是用高于临界胶束浓度的表面活性剂作流动相,代替一般液相色谱的水和有机溶剂做流动相,被分离溶质在固定相和胶束相及水相之间进行分配,在水溶液中形成的胶束称为正相胶束,可用于反相色谱;在非极性溶液中形成反相胶束,可用于正相色谱。
 
29. 胶束液相色谱的特点?
答:胶束液相色谱有以下特点:
1、可不使用有毒的流动相;
2、在用梯度洗脱时不需要色谱柱和流动相之间进行平衡;
3、不影响使用电化学检测器,改进荧光检测器的灵敏度;
4、分析血和尿样时不需要除去蛋白质可直接进样。
 
30. 胶束液相色谱的应用领域?
答:胶束液相色谱主要应用于药物分析和环境监测中。
 
31. 什么是梯度洗脱?
答:所谓梯度洗脱,就是由两种(或两种以上)不同极性的溶剂,在分离过程中按一定程序连续的改变,以改变流动相的配比和极性。
 
32. 梯度洗脱的优点?
答:梯度洗脱有以下优点:
1、可以避免早流出峰分离度不好;
2、可以避免晚流出峰变快、峰高降低;
3、避免混合物容量因子k'范围宽时分析时间长;
4、可以避免保留时间长的组分污染色谱柱。
 
33. 梯度洗脱的使用范围?
答:梯度洗脱适合于以下情况:
1、具有较宽k范围的样品,即所有的组分的色谱峰的k值不在0.5~20之间。
2、大分子样品,相对分子质量大于1000的,尤其是生物样品。
3、样品中含有高保留时间的干扰成分。
4、即使在使用等度时也可以使用梯度洗脱选择流动相的比例。
 
34. 梯度洗脱的分离机理?
答:流动相由几种不同极性的溶剂组成,通过改变流动相中各溶剂组成的比例改变流动相的极性,使每个流出的组分都有合适的容量因子k',并使样品中的所有组分可在最短时间内实现最佳分离。
 
35. 反相色谱填料保留性能的影响因素?
答:反相液相色谱填料保留性能在一定程度上受本身结构和色谱条件的影响。
1、反相色谱填料保留性能随温度不同而变化;
2、反相色谱填料保留性能受键合烷基及流动相的影响。
 
36. 怎么解决反相色谱填料中由于碱性物质吸附而造成的峰形不对称、保留值不稳定的问题?
答:解决此问题的方法有:
1、提纯硅胶;
2、把硅胶“封端”;
3、用空间阻碍掩蔽硅羟基;
4、在烷基链中嵌入极性基团;
5、双齿键合固定相。
 
37. 选择高效液相色谱流动相溶剂的基本要求?
答:用作高效液相色谱流动相的溶剂,首先要满足以下几点基本要求:
1、容易得到; 2、适合于所有的检测器; 3、纯净、有一定的惰性;4、无毒、使用安全;5、对所分离的样品有一定的溶解性能。
 
38. 选择流动相溶剂的基本原则?
答:在选择流动相溶剂时,首先要考虑的是溶剂的物理性质,如沸点、粘度、紫外光吸收的波长范围等;其次要考虑的是溶剂对所分离样品的容量因子,这样又可使溶剂范围缩小了很多;最后要考虑的是溶剂的分离能力,当然分离能力主要是由色谱柱起主要作用,但是在高效液相色谱中流动相也起着不可忽视的作用。
 
39. 为什么低沸点溶剂难以使用往复泵?
答:低沸点的溶剂难以使用往复泵,因为它在泵中容易形成气泡而影响泵的精度,甚至使泵吸入的溶剂减少,此外由低沸点溶剂组成的混合流动相又会因蒸发而改变其组成。
 
40. 什么是高效液相色谱流动相极性?
答:在高效液相色谱中涉及流动相时,由于它在两相分配中起着重要的作用,涉及流动相和被分离物质的相互作用,为了描述它和溶质作用力的大小,有必要对流动相的综合作用力给以定量的表示,就给他一个用“极性”表示量的概念。
 
41. 水溶性样品怎样选择色谱模式?
答:如果是低分子量的样品,而且分子量相差较大,使用小孔填料的排阻色谱法进行分离是比较合适的。如果样品的分子量相差不大,就要考察样品中是否还有离子型或可电离的组分,如样品的组分都是非离子的,最好选用键合相色谱分离,而且应首先试用反相色谱。但在反相色谱中,极性较强的水溶性样品,由于保留值低,很快出峰,分离不好,对于这类样品应该用氨基、二醇基柱的正相色谱进行分离,并用有机溶剂和水的混合液进行洗脱。有些样品可用硅胶柱的吸附色谱,并以含水或甲醇的溶剂进行洗脱。
如果是低分子量离子型有几种方法可以用,如为弱酸或弱碱,最为简单的办法就是完全抑制的电离。如为小分子的无机或有机离子,离子色谱是首选方法,特别是一些无机阴离子,离子色谱法是很简便的分析方法。
 
42. 油溶性样品怎样选择色谱模式?
答:在分离油溶性样品时,开始的步骤与水溶性样品相似,首先应使用体积排阻色谱确定样品分子量大小的特征。分子较大的样品可用适当的大孔硅胶或有机凝胶填料,以有机溶剂为流动相作进一步的分离。对于分子量范围在1000~5000的样品,宜首先使用排阻色谱进行分离。如果样品比较复杂而且分子量接近,则要考虑其他各种模式的高效液相色谱。对离子型或可电离的组分,较为适宜的方法是离子对色谱。
对非离子型样品,如果是强亲脂性的,可用使用有机溶剂为流动相的硅胶吸附色谱。如果样品为弱亲脂性的在极性溶剂中又有一定的溶解性,可以考虑用硅胶为固定相的液固色谱。如果是手性异构体混合物,那就要用手性固定相的色谱方法,或在流动相中添加手性选择剂进行分离。
 
43. 为什么高效液相色谱溶剂纯度要求很高?
答:为了提高检测的灵敏度,而要求溶剂的纯度高。有的杂质可能会跟样品反应,影响结果。如若溶剂中有一些杂质能在色谱柱中发生非特异性吸附,污染色谱柱造成柱效下降。如果杂质在填料上积累了还会形成一些不规则的峰,而强保留杂质的慢解吸会使基线不断升高。
 
44. 为什么高效液相色谱溶剂对含水量有着很高的要求?
答:因为水中的杂质常常带来许多麻烦,特别是在进行痕量的梯度洗脱时尤为明显。一些水中的极性杂质积累于色谱柱的头部,当洗脱剂强度增大时它们流出色谱柱,形成鬼峰,并且影响出峰的组分。
 
45. 为什么高效液相色谱要做光谱分析?
答:高效液相色谱在大多数情况下要使用紫外检测器,所以必须考虑所用溶剂在紫外波段的吸收。如果要用间接紫外波长进行检测则应选用吸收强度强烈的溶剂或添加剂。如使用示差遮光检测器,自然要考虑溶剂的折射率。因为示差折光检测器的灵敏度与流动相和样品折射率的差值成正比例。
 
46. 为什么高效液相色谱要控制醛、酮含量?
答:有许多溶剂可能与样品发生反应,或在某些固定相的存在下产生聚合,它们就不能作为流动相使用。所以高效液相色谱中几乎不使用醛、烯、含硫化学物作溶剂;酮和硝基化合物也很少使用。
 
47. 常用的反相高效色谱的溶剂?
答:在有机溶剂中反相高效液相色谱使用最多的是甲醇和乙腈,它们具有最高的洗脱能力和强度。
 
48. 常用的正相高效色谱溶剂?
答:其流动相是不同的混合溶剂,常以乙烷或环己烷做基础溶剂,为了洗脱极性较强的溶质,往基础溶剂中加入极性溶剂,如二氯甲烷,短链醇,四氢呋喃等。
 
49. 常用的反相离子对色谱的流动相?
答:反相离子对色谱常用的流动相是甲醇-水和乙晴-水,增加甲醇或乙晴比例,k值减少。
 
 
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